L'extraction de fluide à densité et température contrôlées dans un biofilm bactérien est déterminée par poly

npj Biofilms et Microbiomes volume 8, Numéro d'article : 98 (2022) Citer cet article

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Une caractéristique des biofilms microbiens est l'autoproduction d'une matrice moléculaire extracellulaire qui enveloppe les cellules résidentes. La matrice offre une protection contre l'environnement, tandis que l'hétérogénéité spatiale de l'expression des gènes influence la morphologie structurelle et la dynamique de propagation des colonies. Bacillus subtilis est un système bactérien modèle utilisé pour découvrir les voies de régulation et les éléments constitutifs clés nécessaires à la croissance et au développement du biofilm. Dans ce travail, nous rapportons l'émergence d'une population très active de bactéries au cours des premiers stades de la formation du biofilm, facilitée par l'extraction de fluide du substrat d'agar sous-jacent. Nous traçons l'origine de cette extraction fluide à la production d'acide poly-γ-glutamique (PGA). L'activité dépendante des flagelles se développe derrière un front fluide fluide qui se propage de la limite du biofilm vers l'intérieur. L'étendue de la prolifération des fluides est contrôlée par la présence de polysaccharides extracellulaires (EPS). Nous constatons également que la production de PGA est positivement corrélée avec des températures plus élevées, ce qui entraîne des morphologies de biofilm matures à haute température qui sont distinctes de l'architecture de biofilm de colonie rugueuse généralement associée à B. subtilis. Bien que des rapports antérieurs aient suggéré que la production de PGA ne joue pas un rôle majeur dans la morphologie du biofilm dans l'isolat non domestiqué NCIB 3610, nos résultats suggèrent que cette souche produit des matrices de biofilm distinctes en réponse aux conditions environnementales.

Une stratégie courante employée par les bactéries pour atténuer les stress imposés par leur environnement consiste à coexister dans des communautés sessiles appelées biofilms. La transition de la vie unicellulaire à la vie multicellulaire permet aux résidents de coordonner les réponses aux stimuli, de partager les charges métaboliques1 et de se protéger contre les attaques externes par les prédateurs2,3 ou les agents antimicrobiens4,5. Ce comportement est omniprésent dans le monde microbien et une compréhension claire de la genèse, du développement et de la maturation des biofilms est importante à la fois d'un point de vue microbiologique fondamental, mais aussi en raison de leur impact sur de nombreux secteurs industriels, cliniques et biotechnologiques. Par exemple, les biofilms sont à l'origine de nombreuses infections chroniques et leurs caractéristiques physiques les rendent difficiles à éradiquer6,7. Cette intransigeance peut également avoir un impact sur les processus industriels, où les biofilms peuvent entraîner des blocages de tuyaux, induire de la corrosion ou contaminer des produits8,9,10. Cependant, bien que la formation de biofilms ait de nombreuses conséquences négatives, les biofilms microbiens jouent un rôle vital dans le traitement des eaux usées et d'autres processus de bioremédiation11,12,13,14 et comprendre leur formation ainsi que leur perturbation est d'un intérêt fondamental.

Bacillus subtilis est une bactérie Gram-positive qui a été largement utilisée comme organisme modèle pour étudier la régulation génétique et les mécanismes moléculaires de la formation de biofilm15,16. Les principaux composants de la matrice produite par B. subtilis sont la protéine fibrillaire TasA17, le surfactant protéique de type hydrophobine BslA18,19,20 et le polysaccharide synthétisé par les produits de l'opéron epsA-O21. L'une des principales voies de régulation qui contrôle l'expression de ces composants est modulée par le facteur de transcription Spo0A, avec des niveaux modérés de Spo0A phosphorylée activant la transcription de l'opéron sinI-sinR22,23. SinR est un facteur de transcription se liant à l'ADN qui contrôle la production de matrice en interagissant avec les promoteurs epsA-O et tapA-sipW-tasA24. Lorsque SinR se lie à ses protéines antagonistes (SinI et SlrR), la répression est atténuée par ces opérons et la formation de biofilm peut se poursuivre25,26.

Dans ce travail, nous rapportons l'observation de plusieurs fronts de fluides mobiles qui se développent au début de la formation du biofilm de la colonie de B. subtilis. Après le dépôt initial des cellules fondatrices, une population de bactéries très mobiles émerge qui nage dans le liquide extrait du substrat d'agar sous-jacent. Nous lions génétiquement ce front de fluide en mouvement à la production du polymère acide poly-γ-glutamique (PGA). Nous constatons que l'afflux de liquide dépend à la fois de la densité bactérienne et de la température ambiante, et que l'étendue de l'infiltration de liquide est à son tour modulée par la production de polysaccharide extracellulaire (EPS). La production de PGA à des températures plus élevées et l'extraction concomitante de fluide ont un impact significatif sur la morphologie du biofilm mature, qui diverge de la structure typique associée à B. subtilis NCIB 3610. Nos résultats suggèrent que B. subtilis a la capacité de produire une matrice extracellulaire alternative en réponse aux conditions environnementales.

Au début de chaque expérience, une suspension de 3 μL de cellules de B. subtilis (DO600 = 1) a été déposée sur MSgg agar, un milieu minimal favorisant le biofilm27. Après l'inoculation, la gouttelette s'évapore, ce qui donne un motif de dépôt en « anneau de café » : un anneau à haute densité de cellules bactériennes se forme au bord de la gouttelette initiale tandis que l'intérieur est moins peuplé (Fig. 1a). Cette distribution des cellules fondatrices est causée par le taux différentiel d'évaporation à travers la gouttelette, entraînant des flux capillaires qui transportent les cellules de l'intérieur à la limite entre la gouttelette et la gélose solide28. Nos expériences initiales ont été réalisées à l'aide de l'isolat de type sauvage NCIB 3610 cultivé à 38 ∘C tandis que des images résolues dans le temps ont été collectées. Les images ont été capturées par imagerie à travers le substrat d'agar, nous avons ainsi observé la dynamique de croissance sur la face inférieure du biofilm (Fig. 1a). Nous avons acquis des images pour les ~ 6 h initiales de croissance (Fig. 1b – d). La région « anneau de café » à haute densité est clairement identifiable par la grande accumulation de cellules bactériennes près de la limite externe de la colonie (Fig. 1b). Cette région de bactéries à haute densité semble être multicouche avec une largeur de 75 à 100 μm.

a Une gouttelette de 3 μL d'une suspension bactérienne est déposée sur la surface de la gélose MSgg et laissée sécher. En raison des taux différentiels d'évaporation à travers la surface de la goutte (flèches bleues), des flux capillaires sont induits à l'intérieur de la goutte. Cela permet le transport des bactéries de l'intérieur de la gouttelette vers le bord où elles se déposent. L'effet est une accumulation d'une région de densité plus élevée de bactéries au niveau de la ligne de contact entre la gouttelette et la gélose solide. b Cette région de bactéries à plus forte densité est visible au bord de la colonie (t = 60 min). c Après trois heures d'incubation et de croissance, une région plus sombre se développe centrée sur le bord du biofilm émergent. Nous constatons que cette zone est fluide et commence à se déplacer vers l'intérieur vers le centre de la colonie (flèches bleues ; t = 220 min). Dans cette zone on observe des cellules actives et mobiles. d Après encore deux heures, le front cesse de se déplacer vers l'intérieur, indiqué par la ligne pointillée blanche, et la motilité s'arrête (t = 330 min). Les barres d'échelle (b) – (d) sont de 500 μm. e Analyse PIV montrant le champ d'amplitude de vitesse d'un biofilm de type sauvage sur un intervalle de deux images (10 fps). La région bleue est le biofilm de la colonie ; la région rouge est l'agar. Image capturée ~ 4,5 h après le dépôt. f À l'aide d'un logiciel de suivi des particules, les billes sont localisées (rose) et leur mouvement suivi dans le temps (lignes jaunes). La majorité des billes se déplacent linéairement à une vitesse constante vers l'intérieur de la colonie. Image capturée ~ 200 min après le dépôt. Barres d'échelle (e)–(f) 100 μm.

Après que NCIB 3610 ait poussé pendant environ 3 h, nous observons une zone, émergeant de la région à haute densité, qui est visuellement différente de l'intérieur de la colonie (cf l'anneau sombre au bord par rapport à l'intérieur plus clair sur la Fig. 1c). Cette zone plus sombre se développe et se déplace vers l'intérieur comme un front mobile vers le centre de la colonie (Film supplémentaire 1). Dans cette zone, nous observons des modèles cohérents de mouvement auto-organisé tels que des tourbillons et des vortex, rappelant les structures observées dans les systèmes turbulents actifs (Supplémentaire Film 2)29,30 qui indiquent que les bactéries sont maintenant dans un environnement fluide. Nous avons utilisé la vélocimétrie par images de particules (PIV) pour évaluer plus en détail ce mouvement. Nous avons trouvé des régions localisées de vorticité élevée et des vitesses allant de 1 à 10 μm/s avec une moyenne de 2,1 μm/s (Fig. 1e, Fig. 1 supplémentaire, Films supplémentaires 3, 4). Pour déterminer si ces modèles émergents étaient dus à l'advection passive des bactéries due aux écoulements de fluide ou si la motilité bactérienne était impliquée, nous avons effectué des expériences similaires et PIV sur une souche non mobile qui possède une délétion de motB, un élément de stator flagellaire requis pour la rotation flagellaire. Nous avons constaté que nous n'observons pas de tourbillons comme nous l'avons fait avec NCIB 3610 (Fig. 2 supplémentaire). De plus, la vitesse moyenne pour la souche motB est d'un ordre de grandeur inférieur à NCIB 3610 (Figs. 2, 3 supplémentaires). Ces observations soutiennent l'idée que les flagelles actifs ou la motilité sont importants pour la formation de ces caractéristiques dynamiques. Que ces modèles soient un exemple de turbulence active due à la motilité bactérienne29, ou en raison d'un couplage entre le battement flagellaire et l'écoulement de liquide dans la colonie à partir de la gélose ci-dessous dépasse la portée de ce travail. Quoi qu'il en soit, ces résultats montrent que les bactéries à cette phase de croissance de la colonie sont dans un environnement fluide. Cette cessation de la motilité/activité se produit également sous la forme d'un front de propagation (le "front d'arrêt de la motilité"), mais il se déplace beaucoup plus rapidement que la propagation initiale du fluide, et se déplace principalement de l'anneau intérieur de l'anneau vers l'anneau de café initial externe (pour les films annotés de ces dynamiques, voir les films supplémentaires 5 et 6).

Pour examiner plus en détail ce front fluide, nous avons ajouté des billes fluorescentes de 2 μm à la suspension de bactéries déposées au début de l'expérience (Fig. 1e, Film supplémentaire 7). Avec l'afflux de fluide, les billes sont poussées à une vitesse constante de ≈2,5 μm min−1 (Fig. 1f). Ainsi, le mouvement de ce front a la capacité de déplacer et de pousser mécaniquement les billes, et probablement les cellules, vers le centre de la colonie. À des stades ultérieurs, certaines billes deviennent erratiques dans leur mouvement, indiquant probablement des billes qui sont mises en mouvement par l'action de nage des bactéries dans un environnement fluide ; une autre partie des billes reste noyée dans la masse bactérienne.

Nous avons systématiquement observé la formation d'un anneau fluide commençant au bord extérieur du biofilm, plutôt que l'engorgement de toute la colonie avec du liquide. Nous émettons l'hypothèse que la restriction du fluide à un anneau externe est due à la production de matrice extracellulaire dans la région centrale du biofilm, empêchant une nouvelle incursion de fluide. Nous avons réalisé la même expérience décrite sur la figure 1a en utilisant une souche dans laquelle le répresseur clé de la formation de biofilm (sinR) est supprimé. Sans sinR, les bactéries surproduisent la matrice extracellulaire et les biofilms de colonies très ridée occupent une empreinte plus petite (Fig. 4 supplémentaire)24. Comme prévu, la distance maximale à laquelle le fluide a empiété à l'intérieur du biofilm par rapport au bord extérieur de la colonie (Figs. 5, 6 supplémentaires; Film supplémentaire 8) dans la souche sinR était environ 3 fois inférieure à la souche NCIB 3610 (Fig. 2).

Tracé est la distance moyenne de déplacement du fluide mesurée à partir du bord du biofilm. Notez que l'axe y est sur une échelle logarithmique pour montrer les différences entre les souches NCIB 3610, sinR, tasA et bslA et epsA-O. Chaque point de données est la distance moyenne de déplacement du fluide en moyenne sur 10 points spatiaux à travers un biofilm individuel (N = 3 pour chaque souche). Les barres d'erreur représentent l'écart type. Il convient de noter que pour la souche epsA-O, la distance parcourue par le fluide reflète simplement la taille de la colonie puisque le fluide émanant de la frontière n'est pas confiné à un anneau mais se réunit au centre. Ici, nous rapportons les distances pour trois expériences distinctes. Un test t non apparié entre NCIB 3610 et chaque mutant de matrice donne des valeurs p de ****p < 0,0001 (sinR), ****p < 0,0001 (tasA), **p = 0,0025 (bslA, ****p < 0,0001 (epsA-O)). p < 0,05 est considéré comme statistiquement significatif.

Ensuite, nous avons voulu déterminer si un ou plusieurs composants individuels de la matrice sont dominants dans le contrôle de l'étendue du flux de fluide. Nous avons effectué des expériences analogues sur des souches avec des délétions dans les gènes responsables de la production de BslA (bslA), TasA (tasA) et EPS (epsA-O), mesurant à nouveau la distance de déplacement du fluide. Nous avons constaté que le fluide se déplaçait plus loin dans la souche bslA par rapport au NCIB 3610, tandis que le débit de fluide dans la souche tasA se déplaçait moins (Fig. 2, Figs supplémentaires. 5, 7, 8; Films supplémentaires 9, 10, 11). Bien que les différences entre le NCIB 3610 et ces composants de la matrice soient statistiquement significatives, le fluide est toujours contenu dans une région annulaire au sein de la colonie. Cependant, pour la souche epsA-O, le fluide n'était pas confiné à une région annulaire, mais s'est plutôt propagé dans tout le rayon de la colonie (Fig. 2, Film supplémentaire 12) et avec une activité cellulaire observable partout. L'activité était très dynamique et nous avons observé la formation de vortex caractéristique de la turbulence active (Supplémentaire Film 13). Encore une fois, nous avons effectué une analyse PIV et trouvé des régions de vorticité élevée et une distribution de vitesse similaire à la souche de type sauvage (Fig. 9 supplémentaire, Films supplémentaires 14, 15). Le front d'arrêt de la motilité est plus apparent chez le mutant epsA-O et, comme le front de propagation fluide, se déplace à travers l'intégralité de la colonie (pour les films édités et annotés de la dynamique du biofilm epsA-O, voir les films supplémentaires 16 et 17). Pris ensemble, nos données démontrent que l'EPS est le principal composant de la matrice extracellulaire qui contrôle l'étendue de l'invasion de fluide dans le biofilm.

La souche epsA-O nous a permis de suivre le flux de fluide dans toute la colonie de manière résolue dans le temps et d'en savoir plus sur le processus d'extraction de fluide. Nous avons remarqué qu'une instabilité en forme de doigt se développait à mesure que le liquide se propageait vers l'intérieur (Fig. 3a ; Films supplémentaires 8, 16-18). Au fur et à mesure que le liquide pousse vers le centre de la colonie, le front de liquide devient instable, formant des doigts de plus en plus gros avec le temps (Fig. 3a, b). Les motifs formés par ces instabilités rappellent le motif de plissement observé dans les biofilms matures.

a Un exemple d'image de microscopie d'un biofilm epsA-O entier (la barre d'échelle est de 500 μm). La région noire annulaire définit la zone où l'on observe des instabilités en forme de doigts. Cette région annulaire est rendue linéaire pour faciliter la visualisation ; une coupe est faite au niveau de la ligne rouge et la région circulaire est "déroulée" pour former une région linéaire. b Images binarisées des doigts au fil du temps pour le biofilm en (a). c Le déplacement normalisé en fonction du temps pour le bord extérieur de la colonie (cercles noirs), le front fluide (losanges verts) et le front d'arrêt de la motilité (carrés oranges). Un plateau dans l'expansion du bord se produit en même temps que le début de la propagation du fluide (que nous définissons comme le « plateau de fluidisation » ; boîte rouge). La croissance recommence après l'arrêt de la motilité. La courbe verte correspond au moment où l'on observe le développement des doigts en (a).

L'imagerie du flux de fluide dans les biofilms de la colonie de cette manière nous a permis de suivre pleinement trois caractéristiques clés de la dynamique : (1) la distance parcourue par le bord extérieur en expansion de la colonie en croissance ; (2) la distance parcourue par le flux de fluide, comme ci-dessus ; et (3) le front d'arrêt de la motilité. Toutes les mesures ont été prises par rapport à la position initiale (r0) de chaque élément, et les distances relatives ont été normalisées par leur valeur maximale pour permettre une comparaison directe de leur évolution en fonction du temps. Premièrement, après un temps de latence, le bord extérieur de la colonie commence à se développer à un rythme constant, comme le montre la figure 3c. Cependant, cette expansion vers l'extérieur ralentit puis s'arrête précisément au moment où nous voyons le front fluide commencer à se propager de l'anneau de caféier à l'intérieur de la colonie. Nous suggérons que l'afflux de liquide provoque une "fluidisation" de la masse du biofilm intérieur, et le manque de robustesse mécanique qui en résulte empêche la poursuite de l'expansion vers l'extérieur du biofilm. Ce n'est qu'avec le début du front d'arrêt de la motilité - et la re-solidification de l'intérieur - qu'une expansion supplémentaire au bord extérieur du biofilm peut se produire. Nous appelons cette pause dans l'expansion du biofilm due à l'afflux de fluide le « plateau de fluidisation » (boîte rouge, Fig. 3c), et nous pouvons l'utiliser pour sonder les changements dans les propriétés du biofilm.

Il est frappant de constater que le front fluide se déplace principalement radialement de «l'anneau de café» vers le centre de la colonie. Ceci suggère que l'espèce moléculaire responsable de l'extraction des fluides est produite de manière dépendante de la densité cellulaire. Pour tester cette hypothèse, nous avons préparé des biofilms de colonies avec et sans une région initiale à haute densité, en enduisant par centrifugation une suspension de bactéries sur l'agar. Les échantillons avec une distribution hétérogène de cellules (en forme d'anneaux de café) extraient toujours le fluide avec une directionnalité : le fluide se propage toujours des régions à haute densité vers les régions à faible densité (Supplémentaire Films 19, 20). En revanche, un dépôt homogène de cellules aboutit finalement à un liquide qui pénètre partout dans la colonie simultanément, sans direction de propagation (Supplementary Movies 21, 22). Ces résultats indiquent qu'il existe une certaine densité cellulaire critique nécessaire pour induire l'extraction de fluide.

Nous avons souhaité identifier les espèces moléculaires responsables de la conduite du flux de fluide et de l'activité et de la dynamique de croissance qui en découlent. La surfactine était un candidat évident : c'est un lipopeptide produit par B. subtilis qui est un puissant biosurfactant31 et un puissant agent antimicrobien32. La production de surfactine dans les biofilms de B. subtilis facilite la propagation des colonies33 et est importante dans l'extraction osmotique du fluide du substrat d'agar sous-jacent34. Pour tester si la surfactine est l'agent causal de la dynamique que nous observons, nous avons supprimé srfAA des souches de fond de type sauvage et epsA-O. En tant que diagnostic, nous avons mesuré le déplacement relatif, r, du bord du biofilm par rapport à la position initiale du bord, r0 en fonction du temps (Fig. 4a). Si la surfactine est responsable du flux de fluide dans le biofilm en croissance, la suppression de srfAA devrait entraîner une expansion sans entrave de la colonie. Cependant, nous avons constaté que les souches srfAA et srfAA epsA-O présentaient le «plateau de fluidisation» caractéristique affiché par la souche parentale (Fig. 4a); par conséquent, la surfactine n'est pas l'agent causal de l'extraction de fluide observée.

a Les mesures du déplacement du bord extérieur à 38 ∘C montrent que les souches NCIB 3610 (cercles noirs), epsA-O (losanges verts), srfAA (violet plus) et srfAA epsA-O (étoile grise) possèdent le "plateau de fluidisation" caractéristique. Les souches pgsB moins (carré orange) et pgsB epsA-O moins (croix cyan) qui ne peuvent pas produire de PGA n'ont pas présenté ce comportement. Morphologie de la colonie après 48 heures d'incubation à 38 °C de b NCIB 3610, c pgsB, d srfAA, e epsA-O, f pgsB epsA-O et g srfAA epsA-O. La barre d'échelle est de 5 mm.

L'acide poly-γ-glutamique est un biopolymère naturel constitué d'unités répétitives d'acide L-glutamique, d'acide D-glutamique ou des deux, produites par des espèces de Bacillus35,36. La production de PGA dépend de la densité37, conformément à nos observations, et possède des propriétés humectantes38,39. Pour tester si le PGA est responsable de l'extraction du fluide, nous avons supprimé pgsB des souches de fond de type sauvage et epsA-O. La PgsB est la synthétase essentielle requise pour la production de PGA40. Nous avons observé un plateau de fluidisation dans l'expansion de la colonie pour les souches de type sauvage et epsA-O, mais pas pour les deux mutants pgsB (Fig. 4a). En l'absence de PGA, le biofilm ne se "fluidise" pas et l'expansion du biofilm se poursuit sans interruption. Nous concluons donc que le PGA est l'agent moléculaire qui extrait le fluide du substrat, entraînant le début de la motilité et la fluidisation du biofilm.

Nous avons également imagé la morphologie du biofilm après 48 heures d'incubation et avons constaté que le mutant de type sauvage et pgsB sont morphologiquement similaires (Fig. 4b, c). Les deux souches epsA-O sont également comparables, mais différentes de la morphologie de type sauvage (Fig. 4e, f). Pour être complet, nous avons également imagé les biofilms mutants de surfactine et constaté que la souche srfA est structurée mais occupe une petite empreinte, tandis que le double mutant srfA pgsB est moins structuré, similaire aux autres souches non productrices d'EPS (Fig. 4d, g). Par conséquent, comme discuté ci-dessus, le flux de fluide dans le biofilm de la colonie aux premiers temps ne modifie pas sensiblement la morphologie, et la production de matrice régit toujours les phénotypes structurels des biofilms matures.

Notre analyse initiale a été effectuée à 38 ∘C tandis que la plupart des autres études portant sur la formation de biofilms de B. subtilis sont généralement menées entre la température ambiante et 30 ∘C. Nous avons donc émis l'hypothèse que la production de PGA n'est pas seulement dépendante de la densité cellulaire, mais également dépendante de la température. Pour tester cette hypothèse, nous avons répété les expériences examinant la morphologie du flux de fluide et du biofilm de la colonie avec des souches de type sauvage, epsA-O, pgsB et pgsB epsA-O aux températures supplémentaires de 30 ∘C et 42 ∘C (la température la plus élevée réalisable dans notre incubateur de microscopie). À 30 ° C, nous n'avons observé aucun écoulement de fluide dans le biofilm de la colonie et aucun plateau de fluidisation dans l'expansion des bords pour aucune des souches, même les souches de type sauvage et epsA-O (Fig. 5a). Ce résultat suggère que le PGA n'est pas produit à 30 °C. Aux températures plus élevées de 38 ∘C et 42 ∘C, nous trouvons un plateau dans les courbes d'expansion des bords pour les souches capables de produire du PGA, bien que le plateau à la température plus élevée soit moins prononcé. Aucun plateau n'est observé pour les mutants déficients en PGA (figures 4a et 5b).

a Mesures de l'expansion du bord à 30 ∘C et b 42 ∘C pour NCIB 3610 (cercle noir), epsA-O (losange vert), pgsB (carré orange), pgsB epsA-O (croix cyan). Morphologie de la colonie après 48 h d'incubation à c–f 30 ∘C et g–j 50 ∘C. La barre d'échelle est de 5 mm. k Analyse de l'abondance de PGA par électrophorèse sur gel de polyacrylamide d'échantillons extraits de NCIB 3610 et de pgsB après croissance à 38 ∘C et 50 ∘C.

Nous avons également constaté que NCIB 3610 forme des colonies extrêmement mucoïdes sur des plaques de gélose MSgg à 50 ∘C (Fig. 5g). La mucosité était telle que lorsque la boîte de Pétri était renversée, la biomasse tombait sur le couvercle. Nous avons observé des phénotypes similaires pour les colonies incapables de produire de l'EPS et de la surfactine (Fig. 5h, Fig. 10 supplémentaire). Nous avons découvert que le phénotype mucoïde était directement lié à la production de PGA, car les souches de suppression de pgsB étaient entièrement non mucoïdes (Fig. 5i, j). Pour terminer, les mêmes souches ont été examinées à 30 ° C et aucune différence dans la structure de l'architecture du biofilm de la colonie NCIB 3610 et pgsB n'a été observée (Fig. 5c, e); de même, les mutants epsA-O et pgsB epsA-O sont morphologiquement comparables (Fig. 5d, f). Pour étayer les données phénotypiques, nous avons collecté la biomasse des souches NCIB 3610 et pgsB cultivées à 38 ∘C et 50 ∘C et évalué biochimiquement la production de PGA. Nous concluons que 3610 produit de grandes quantités de PGA à 50 ∘C mais pas à 38 ∘C (Fig. 5K). Les mutants matriciels de NCIB 3610 contenant des délétions dans bslA, tasA et epsA-O forment des biofilms mucoïdes similaires à 50 ∘C (Fig. 10 supplémentaire). Seul le mutant possédant une délétion dans sinR, tout en restant mucoïde, produit un biofilm aux caractéristiques structurelles rugueuses (Fig. 10 supplémentaire). Collectivement, nos données appuient la conclusion que le PGA est produit dans le NCIB 3610 à la fois en fonction de la densité cellulaire et de la température, et montrent que l'architecture et la structure du biofilm peuvent, dans certaines conditions, être considérablement influencées par la production de PGA.

Nous avons montré que B. subtilis produit du PGA qui induit un flux de fluide dans une colonie de biofilm en croissance. Cette remontée de fluide conduit à une activité dépendante des flagelles cellulaires qui, dans ces conditions de haute densité et de confinement, se traduit par une dynamique turbulente. Il a été bien établi que les états cellulaires producteurs de matrice mobile et de biofilm sont mutuellement exclusifs41,42 ; les cellules individuelles ne peuvent être que dans l'un des deux états. Il a également été démontré pour les espèces Gram-positives et Gram-négatives que la motilité flagellée active est souvent nécessaire pour le développement du biofilm et que le rôle qu'elle joue est multiple43,44,45,46,47,48.

On ne sait pas encore quelle fonction la motilité induite par le PGA peut jouer dans le développement du biofilm de B. subtilis. Il est intrigant que les mêmes régulateurs transcriptionnels requis pour la motilité49 soient également nécessaires pour la synthèse de PGA37,50,51. Cependant, des travaux antérieurs ont également montré qu'il existe une relation inverse entre la synthèse de PGA et la fonction flagellaire52,53, suggérant que la motilité que nous observons peut simplement être un sous-produit du fait que les cellules se trouvent dans un environnement fluide. Les mécanismes de régulation précis qui contrôlent la synthèse et la motilité du PGA sont complexes et des travaux supplémentaires sont nécessaires pour mieux comprendre les liens entre les deux.

D'après nos expériences, il est clair que des températures élevées incitent la colonie à retirer un volume considérable de liquide du substrat de gélose. Des travaux antérieurs ont montré que le PGA peut conférer une protection aux bactéries et augmenter la survie sous de nombreux stress environnementaux différents54,55,56,57. Il est plausible que lorsqu'un biofilm est soumis à des températures élevées, la production de PGA piégerait et retiendrait l'humidité qui, autrement, pourrait être perdue par évaporation, empêchant ainsi la dessiccation de la colonie. Notre observation du début de la motilité met en évidence un autre avantage potentiel de la production de PGA dans un environnement changeant : la propagation active (ou même passive) peut faciliter la fuite et la recherche d'environnements plus appropriés pour coloniser.

La matrice du biofilm de B. subtilis et de V. cholerae a été modélisée comme un réseau d'hydrogel visqueux qui facilite l'expansion du biofilm via un afflux de fluide osmotique58,59,60,61. On pense que la localisation de la production d'EPS à la limite de propagation d'une colonie en croissance entraîne l'expansion vers l'extérieur du biofilm. La production concomitante d'osmolytes stimule l'extraction de fluide qui gonfle la matrice à la limite de croissance, entraînant le mouvement vers l'avant. Dans nos expériences, le PGA semble avoir l'effet inverse : l'expansion de la colonie s'arrête en raison de l'entrée de la colonie dans un état "liquide" lorsque le fluide est extrait du substrat. Des travaux antérieurs ont montré que l'expansion du biofilm de la colonie est fortement régie par les forces de contact mécaniques entre les cellules voisines et la friction avec le substrat sous-jacent62,63,64. Dans nos expériences, l'expansion ne recommence que lorsque l'environnement fluide se dissipe, les contacts physiques sont rétablis et la production de matrices non PGA commence. Cela soulève une autre question : comment se produit l'expansion des colonies lorsque le PGA est le composant principal de la matrice ? Nos expériences à haute température montrent que la souche 3610 de type sauvage se développe de manière significative au-delà de l'empreinte de dépôt initiale. Les souches qui ne produisent pas d'EPS ou de surfactine ne se développent pas autant que le type sauvage, ce qui laisse entendre que ces composants ont un rôle à jouer dans la facilitation de l'expansion des colonies (Fig. 10 supplémentaire).

Les ondes progressives de fluide dans la souche déficiente en epsA-O entraînent l'apparition de structures en forme de doigt lorsque l'onde se propage vers l'intérieur. De telles instabilités de doigté peuvent se produire lorsqu'un fluide à faible viscosité déplace un fluide à viscosité plus élevée; la situation inverse se traduira généralement par une interface stable. Curieusement, dans nos expériences les doigts se présentent dans la configuration inverse. De telles instabilités inverses de Saffman-Taylor peuvent se produire par l'ajout de particules mouillables qui peuvent s'adsorber à l'interface air/fluide et induire des instabilités interfaciales65. On sait que les bactéries peuvent s'accumuler aux interfaces66, et B. subtilis le démontre en formant des biofilms flottants (pelliculaires). Nous supposons que dans notre système expérimental, les cellules de B. subtilis s'accumulent à l'avant de l'onde de fluide entrante, modifiant l'énergétique interfaciale et déstabilisant l'interface entre le fluide et l'air, et donnant lieu à l'instabilité de doigté observée. La localisation des cellules à ces interfaces peut également donner lieu à des gradients de densité cellulaire, qui à leur tour peuvent évoluer en tant que modèles dans le biofilm mature. Davantage de travail devra être fait pour découvrir les mécanismes biologiques et physiques qui causent ce phénomène inhabituel et tout avantage ou fonction possible dans les milieux écologiques.

Nos expériences à des températures intermédiaires (38 ∘C) suggèrent une séparation spatiale entre les cellules productrices de PGA au bord du biofilm de la colonie et les cellules productrices de matrice au milieu (comme cela a déjà été rapporté67), entraînant le confinement annulaire du fluide. Une telle hétérogénéité spatiale et temporelle est une caractéristique commune dans les biofilms où le microenvironnement local peut fortement influencer l'état phénotypique des cellules. L'hétérogénéité phénotypique au sein d'un biofilm peut être générée à partir de variations de l'environnement chimique ou physique68,69, de variations génotypiques et de l'expression stochastique des gènes68.

L'hétérogénéité de la densité cellulaire imposée par les conditions de dépôt initiales - et la formation de «l'anneau de café» - conduit au modèle spatial d'extraction de fluide que nous observons. Cependant, ce n'est pas le seul moyen de générer des différences de densité au sein d'un biofilm. Les agrégats formés lors de la croissance en culture liquide peuvent ensemencer des plaques de densité cellulaire plus élevée sur l'empreinte de dépôt. En effet, nous observons que l'invasion de fluides et, par inférence, la production de PGA peuvent se produire dans de petites régions localisées éloignées du « cercle de café » (film supplémentaire 23). Cela suggère qu'il existe une densité cellulaire critique qui détermine si une cellule individuelle adopte un état producteur de PGA plutôt qu'un état producteur de matrice.

L'hétérogénéité spatiale est transitoire à 38 ∘C et l'EPS devient le composant dominant de la matrice qui détermine la morphologie du biofilm à grande échelle. Le flux de fluide est finalement arrêté par la production de l'élément EPS de la matrice dans la région médiane du biofilm (Fig. 6b). Les cellules mobiles proches des cellules productrices d'EPS semblent s'arrêter brusquement de bouger et un front solide progresse rapidement du milieu de la colonie vers l'extérieur. Un mécanisme qui pourrait expliquer cette transition implique l'engagement d'un "embrayage moléculaire" comme EpsE, qui se lie à FliG et déclenche l'arrêt de la motilité70. Cependant, nous pouvons exclure EpsE comme candidat puisque nous observons la propagation du front d'arrêt de la motilité dans la souche epsA-O. La question reste ouverte de savoir quel(s) mécanisme(s) physique(s) ou biologique(s) régissent ce phénomène de type interrupteur.

Le "coffee ring" est la région initiale de densité plus élevée qui se forme après dépôt sur la surface de la gélose. a Les basses températures produisent une matrice de biofilm riche en EPS et TasA (jaune). b Les températures intermédiaires induisent la production de PGA (bleu) et (i) l'extraction concomitante de fluide de l'agar qui provient de la région à haute densité. (ii) Le fluide se propage vers le centre où (iii) la production de matrice EPS et TasA arrête sa progression. c Des températures élevées donnent une matrice riche en PGA qui induit (i) une extraction fluide qui (ii) recouvre l'intégralité du biofilm, ce qui donne un phénotype mucoïde.

À basse température, nous n'avons pas observé l'hétérogénéité phénotypique que nous observons à des températures intermédiaires, probablement en raison d'un manque de production de PGA (Fig. 6a) malgré la densité cellulaire élevée dans l'anneau de café. Inversement, à des températures élevées, les biofilms sont extraordinairement mucoïdes et manquent de toute structure discernable typique d'un biofilm de B. subtilis (Fig. 6c). Dans les deux extrêmes, toute production de PGA dépendante de la densité cellulaire est remplacée par une voie dépendante de la température qui a un impact sur l'ensemble du biofilm.

Lorsqu'ils sont conçus pour surproduire les fibres TasA et l'exopolysaccharide par l'introduction d'une mutation dans sinR, les biofilms formés à haute température (Fig. 10 supplémentaire) étaient hautement mucoïdes mais possédaient également une morphologie plus typique d'un biofilm de B. subtilis de type sauvage. Cela implique que la production de PGA peut se produire simultanément avec EPS/TasA, même si des cellules individuelles de la population s'engagent dans la production de l'un ou l'autre produit. Cette bifurcation en deux populations est suggérée par nos découvertes à des températures intermédiaires, où les deux types cellulaires semblent être présents en même temps, mais dans des régions différentes du biofilm.

Des travaux antérieurs ont montré que les souches possédant une délétion de spo0A entraînaient des biofilms mucoïdes et non structurés à basse température (30 ∘C) et que cela était dû à la production de PGA27,71. Par conséquent, un mutant spo0A imite largement le phénotype de biofilm de type sauvage que nous observons à des températures élevées. Cela implique que Spo0A peut être le composant régulateur qui contrôle la production dépendante de la température d'une matrice de biofilm riche en PGA ou riche en EPS/TasA.

Pris ensemble, ces résultats impliquent que B. subtilis a la capacité de produire différentes matrices de biofilm avec des propriétés distinctes pour s'adapter à des conditions environnementales disparates. Une telle stratégie peut être employée dans les milieux naturels étant donné que B. subtilis peut se développer dans une large gamme de températures : on le trouve dans les sols désertiques et dans les composts qui peuvent facilement atteindre des températures de 50 ∘C. Jusqu'à présent, le PGA n'était pas considéré comme un facteur important en tant que composant de la matrice dans les biofilms de B. subtilis NCIB 361037. Cependant, il semble que, dans les bonnes conditions, le PGA puisse devenir un composant de matrice alternatif avec des caractéristiques structurelles et physiques distinctes qui peuvent aider le biofilm à survivre dans des conditions de température élevée.

Les souches de B. subtilis ont été initialement cultivées dans du milieu LB (10 g de NaCl, 5 g d'extrait de levure et 10 g de tryptone par litre). Les biofilms ont été cultivés sur de la gélose MSgg (5 mM de phosphate de potassium et 100 mM de MOP à pH 7,0 additionnés de 2 mM de MgCl2, 700 μM de CaCl2, 50 μM de MnCl2, 50 μM de FeCl3, 1 μM de ZnCl2, 2 μM de thiamine, 0,5 % v/v de glycérol, 0,5 % p/v glutamate, 1,5 % w/v Select Agar (Invitrogen) Le cas échéant, des antibiotiques ont été utilisés selon les besoins aux concentrations suivantes : chloramphénicol à 5 μg ml-1, kanamycine à 25 μg ml-1, spectinomycine à 100 μg ml-1 et tétracycline à 10 μg ml-1.

Toutes les souches utilisées dans cette étude sont fournies dans le tableau supplémentaire 1. Toutes les souches de B. subtilis utilisées dans ce travail sont dérivées de l'isolat de laboratoire de type sauvage NCIB 3610 et construites à l'aide de protocoles standard. La transduction du phage SPP1 a été utilisée pour le transfert de l'ADN génomique de la souche donneuse dans le receveur NCIB 3610.

Les biofilms de colonies ont été cultivés pendant 24 h, moment auquel la biomasse a été récoltée à partir de la surface de la gélose et placée dans une aliquote de 500 μl de BugBuster® Mastermix (Merck). Le matériau a été rompu par passage répété à travers une aiguille de calibre 23, puis sonication (30 % d'amplitude, 10 s). Les échantillons ont été incubés à 21 ∘C (avec agitation) pendant 20 min et centrifugés à 4 ∘C (17 000 × g) pendant 10 min. Le surnageant a été retenu et contenait du PGA et des protéines extraites. Les échantillons ont été quantifiés à l'aide d'un kit d'analyse de protéines Pierce BCA (Thermo Scientific) et stockés à -20 ∘C avant une analyse plus approfondie.

Les échantillons contenant 10 μg de protéines totales (normalisées à 25 μl dans un tampon d'échantillon laemelli 1x) ont été analysés par SDS-PAGE (gel de résolution 12 % p/v et gel d'empilement 7 % p/v) aux côtés d'une échelle de poids moléculaire (Precision Plus Protein Dual Color Standards (Biorad)). Tous les gels ont été traités en parallèle et ont été exécutés à 180 V jusqu'à ce que le front de colorant bleu dans le colorant de chargement de l'échantillon atteigne le fond du gel. Les gels d'acrylamide ont été soigneusement rincés à l'eau et trempés dans une coloration protéique Instant Blue Coomassie (Abcam) pendant 1 h avec un léger balancement. Après incubation dans le colorant, les gels ont été rincés à l'eau déionisée et imagés à l'aide d'un système Molecular Imager Gel Doc XR (Biorad). Les gels ont ensuite été trempés dans du bleu de méthylène à 0,5 % (p/v) dans de l'acide acétique à 3 % (v/v) pendant 10 min, puis lavés à plusieurs reprises dans de l'eau déionisée jusqu'à ce que le colorant de fond non lié soit éliminé.

Des souches de B. subtilis ont été inoculées dans 3 ml de LB à partir d'une seule colonie cultivée sur de la gélose LB à 1,5 % p/v. Les bactéries ont été laissées se développer à 30 °C avec une agitation orbitale de 200 tr/min jusqu'à atteindre une DO entre 1,5 et 2. La culture cellulaire a été diluée à DO600 1,0 dans une solution saline tamponnée au phosphate. Une goutte de 3 μL de bactéries a été déposée sur une boîte de pétri de 35 mm (Corning) contenant de l'agar MSgg. Les gouttelettes de bactéries ont été laissées sécher pendant 10 min. Pour les échantillons préparés par spin-coating, une boîte de Pétri contenant de la gélose MSgg a été placée sur un spin-coating sous vide (Cammax Precima) tournant à 2000 tr/min. Une goutte de 10 μL de bactéries a été placée sur la gélose rotative. Pour toutes les expériences, la boîte de Pétri a été placée sur un microscope inversé Nikon Ti à température contrôlée. Toutes les images et vidéos de microscopie ont été capturées à l'aide d'une caméra CCD CoolSNAP HQ2 contrôlée par le logiciel μManager. Des films à fond clair et des images des biofilms ont été capturés à partir du dessous de la boîte de Pétri et sont imagés à travers l'agar (épaisseur ~ 4 mm). Des objectifs Nikon Plan 2x UW et 10X Plan Fluor ont été utilisés pour l'acquisition d'images. Une imagerie supplémentaire du biofilm a été réalisée à l'aide d'un stéréoscope Leica MZ16. Pour les expériences de suivi des billes, des billes fluorescentes jaunes de polystyrène modifiées au carboxylate de latex de 1 μm de diamètre (Sigma-Aldrich) ont été diluées dans du PBS à partir de la solution mère dans un rapport de 1: 1000. 1 μL de la solution de travail a été ajouté au 1 mL de la culture cellulaire diluée juste avant le dépôt. Les films ont été acquis dans des canaux lumineux et épifluorescents (cube de filtre fluorescent Nikon GFP) et les billes ont été suivies à l'aide du plugin ImageJ TrackMate (v3.8.0)72. L'analyse d'image a été effectuée à l'aide de la distribution Fidji d'ImageJ. Des images de microscopie de biofilm entières ont été capturées comme ci-dessus, mais dans plusieurs tuiles qui ont été cousues ensemble à l'aide du plug-in "Pairwise Stitching". Les images des instabilités de doigté ont été générées en utilisant d'abord l'outil « Redresser » pour transformer une circulaire en une région linéaire. La méthode de seuil ImageJ par défaut a été appliquée pour binariser les images. Dans les cas où l'intensité variait sur l'image, l'image était divisée en régions d'intensité similaire, puis un seuillage était effectué. L'outil de "recherche de bords" a été utilisé pour localiser les bords des images seuillées. Une fois les bords identifiés, l'intérieur a été rempli pour former une représentation des doigts. Si l'image était partitionnée, l'image était assemblée à l'aide de l'outil d'assemblage dans ImageJ. La mesure de la distance parcourue par le fluide a été suivie manuellement dans ImageJ et le déplacement moyen a été moyenné sur 10 mesures distinctes pour chaque expérience. Pour chaque souche étudiée, trois expériences distinctes ont été réalisées. Les mesures de déplacement des bords et du front ont été effectuées de la même manière dans ImageJ en suivant manuellement le mouvement du front sur des images successives. Les déplacements ont toujours été mesurés par rapport à la position initiale de chaque élément. L'analyse PIV a été réalisée à l'aide de PIVlab (v2.39)73,74. Les images ont d'abord été traitées à l'aide d'un filtre CLAHE avec une taille de fenêtre de 20 pixels. Trois passages d'interrogation ont été utilisés avec des tailles de fenêtre de 64/32 pixels, 32/16 pixels et 16/8 pixels. L'estimateur de sous-pixel utilisé était le Gauss 2x3 points. Des masques d'image ont été appliqués pour limiter l'estimation de vecteurs parasites et les vecteurs ont été rejetés s'ils dépassaient 5 écarts-types par rapport à la moyenne.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Toutes les données utilisées dans cette étude seront déposées dans le DataShare d'Édimbourg (https://doi.org/10.7488/ds/3473). Toutes les données sont également disponibles sur demande auprès des auteurs correspondants.

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Nous remercions M. Porter et F. Davidson pour leurs commentaires utiles. Les travaux dans les laboratoires NSW et CEM sont financés par le Biotechnology and Biological Science Research Council (BBSRC) [BB/P001335/1, BB/R012415/1, BB/T00875X/1].

Centre national d'innovation sur les biofilms, École de physique et d'astronomie, Université d'Édimbourg, Édimbourg, EH9 3FD, Royaume-Uni

Ryan J. Morris et Cait E. MacPhee

Division de microbiologie moléculaire, École des sciences de la vie, Université de Dundee, Dundee, DD1 5EH, Royaume-Uni

David Stevenson, Tetyana Sukhodub et Nicola R. Stanley-Wall

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RJM, NSW et CEM ont conçu des expériences. RJM et DS ont réalisé des expériences. TS a réalisé des expériences et créé des souches bactériennes. RJM, CEM et NSW ont rédigé et édité le document. Tous les auteurs se sont mis d'accord sur la version finale de l'article.

Correspondance avec Ryan J. Morris ou Nicola R. Stanley-Wall.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Morris, RJ, Stevenson, D., Sukhodub, T. et al. L'extraction de fluide à densité et température contrôlées dans un biofilm bactérien est déterminée par la production d'acide poly-γ-glutamique. npj Biofilms Microbiomes 8, 98 (2022). https://doi.org/10.1038/s41522-022-00361-5

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Reçu : 04 juin 2021

Accepté : 29 novembre 2022

Publié: 17 décembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41522-022-00361-5

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